一、細(xì)胞復(fù)蘇
將凍存細(xì)胞從液氮中取出后，在37C水浴鍋內(nèi)不斷搖動促進其融化。移人15ml離心管中，加入10m預(yù)熱的DMEM培養(yǎng)基，輕輕吹
勻，離心，2000rpmX2min，棄上清液。加入10mIDMEM培養(yǎng)基清洗，棄上清液。加入10mlDMEM培養(yǎng)基，輕輕吹打，接種于10cm盤中，在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
二、細(xì)胞傳代
細(xì)胞密度達到80%~90%時．去培養(yǎng)基，10mlPBS清洗2次。加入3ml含0．25%EDTA，放人細(xì)胞培養(yǎng)箱3min。加人1mlDMEM
培養(yǎng)基終止，轉(zhuǎn)移至15ml離心管。
加入10mlPBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)盤，轉(zhuǎn)移至15ml離心管，2000rpmX2min，棄上清液。再加入10mlPBS(經(jīng)高壓滅菌，保存于40C)，吹
勻，吸取10微升進行計數(shù)，按照1×106/盤接種，在含5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。
三、細(xì)胞凍存
細(xì)胞密度達到80%～90%時，去培養(yǎng)基，10mlPBS清洗2次。加入3ml含0.25%EDTA，放人細(xì)胞培養(yǎng)箱3min。加入ImlDMEM
培養(yǎng)基終止消化，轉(zhuǎn)移至15ml離心管。加入10mlPBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)盤，轉(zhuǎn)移至15ml離心管，2000rpmX2min，棄上清液。
加入Iml凍存液（90%血清，10%DMSO），放入凍存盒內(nèi)（盒內(nèi)有異丙醇，以保證溫度降低的速度），立即放入一80℃C冰箱內(nèi)，過夜，
第二天放入液氮中，可以保存至少兩年，如不放人液氮，可以保存三個月。
凍存液的配制：70%培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，邊滴邊搖。
進入細(xì)胞間開始細(xì)胞培養(yǎng)時，必須嚴(yán)格按照下列步驟操作：
①確定所有的細(xì)胞操作用的溶液和耗材都已經(jīng)消毒并檢測沒有問題，不確定的溶液和耗材請勿使用，除非特殊情況，不要借用別人的溶
液。
②確定衣服的袖口已經(jīng)卷起或者白大褂的袖口已經(jīng)扎緊。
③確定酒精燈內(nèi)的酒精量，需要的話及時進行補充。
④確定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。為了方便單手開啟瓶蓋，實驗開始可以把所有瓶蓋旋松。
②盡量不要直接傾倒溶液，除非瓶口沒有被燒壞。如果傾倒失敗，溶液粘在瓶口，請用噴過75%酒精的紙巾仔細(xì)清潔瓶口周圍后在火焰上簡單燒灼。6操作時如果不能肯定所用的耗材是潔凈的，必須及時更換。實驗完畢及時收拾，保持工作區(qū)域清潔整齊，后用75%酒精清潔臺面。
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